চিত্রঃ পরীক্ষাগারে নমুনা পরীক্ষাকরণ
Source: Google.com

১.করোনা টেস্ট কোন প্রক্রিয়ায় হচ্ছে?
২. rt-PCR = reverse transcriptase PCR নাকি real time PCR?
৩.ফলস্ নেগেটিভ, ফলস্ পজেটিভ কী?
৪.কীভাবে সনাক্ত করা হয় করোনা রোগী?
৫.কীভাবে সংরক্ষন করা হয় নমুনা?

কোভিড-১৯ পজিটিভ কি না, তা নির্ণয়ের সবচেয়ে বহুল ব্যবহৃত ও জনপ্রিয়, অতি সংবেদনশীল, ব্যয়বহুল পদ্ধতি হচ্ছে rt-PCR বা রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ পিসিআর। এই প্রক্রিয়ায় কোষের মধ্যে থাকা RNA কে DNA তে পরিণত করে তাকে বহুগুণ বাড়িয়ে তা মেশিনের মাধ্যমে পর্যবেক্ষণ ও গণনা করা যায়। আমাদের ডিএনএ মাত্র চারটি নাইট্রোজেন বেস দিয়ে লিখিত। অ্যাডিনোসিন (A), সাইটোসিন (C), থাইমিন (T), গুয়ানিন (G)—এই চারটি যৌগের বিভিন্ন রকম সাজিয়ে নির্ধারণ করে দেয় কোন জিনের কাজ আসলে কী। এই DNA থেকে RNA তৈরি হয় এবং RNA থেকে তৈরি হয় প্রোটিন, যা আমাদের দেহের বিভিন্ন বৈশিষ্ট্যের বহিঃপ্রকাশের জন্য দায়ী। যেমন মনে করতে পারেন একজন মানুষ লম্বা, আরেকজন খাটো—এই ধরনের বৈশিষ্ট্যগুলোর ভিন্নতার জন্য দায়ী হচ্ছে ডিএনএর ক্রমবিন্যাসের ভিন্নতা।

নোবেল করোনাভাইরাস একটি RNA ভাইরাস। অর্থাৎ তার জিনোম RNA দিয়ে তৈরি। মানুষের দেহে এই ভাইরাসটি আছে কি না, তা পর্যবেক্ষণের জন্য আমরা মানুষটির nasopharyngeal swab (সর্দি) বা কাশির থেকে নমুনা সংগ্রহ করে সেই কোষগুলো থেকে RNA আলাদা করতে পারি। যদি ভাইরাসের সংক্রমণ থাকে তাহলে অবশ্যই মানুষটির নিজের RNA সঙ্গে সঙ্গে ভাইরাসটির RNA টিও আমাদের নমুনায় চলে আসবে। এরপর rt-PCR নামক পদ্ধতির মাধ্যমে আমরা RNA থেকে এর একটি DNA প্রতিলিপি তৈরি করে সেই ডিএনএকে বহুগুণে বাড়াতে পারি । ভাইরাসের নিজের দেহে DNA না থাকলেও আমরা ল্যাবে কৃত্রিমভাবে এর RNA থেকে DNA মত করে একটি প্রতিলিপি তৈরি করতে পারি। DNA থেকে RNA তৈরির প্রক্রিয়াটিকে বলে ট্রান্সক্রিপশন এবং এর বিপরীত অর্থাৎ RNA থেকে DNA তৈরির প্রক্রিয়াটি হলো রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন, যা রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ নামক একটি এনজাইমের ব্যবহারের মাধ্যমে হয়ে থাকে। এই থেকে rt-PCR নামের প্রথম অংশের উৎপত্তি।

এখন PCR নামের অর্থ জানতে আমাদের পরিচিত হতে হবে পলিমারেজ নামের আরেকটি এনজাইমের সঙ্গে।যা পলিমারেজ নামে পরিচিত, যা DNA থেকে RNA তৈরি করতে পারে। আমাদের দেহের ভেতরে পলিমারেজ এনজাইম প্রতিনিয়ত DNA থেকে DNA প্রতিলিপি বানিয়েই চলছে। পলিমারেজ এনজাইম দিয়ে পরীক্ষাগারে PCR মেশিনের সাহায্যে একটি ডিএনএ থেকে দুটি, দুটি থেকে চারটি, চারটি থেকে আটটি এভাবে সূচক-হারে ডিএনএ অণুর সংখ্যা লক্ষ-কোটি গুণ বাড়ানো সম্ভব। যেমন এমন পাঁচটি চক্রের পর ডিএনএ বেড়ে যাবে ২৫ অর্থাৎ ৩২ গুণ এবং ২০টি চক্রের পরে ২২০ = ১০,৪৮,৫৭৬ গুণ। একটু চিন্তা করে দেখুন ৪০টি চক্রের পর ডিএনএর সংখ্যা কতগুণ বেড়ে যাবে। এই আনুপাতিক হারে ডিএনএর সংখ্যা বাড়ানোর প্রক্রিয়াটিকে বলে polymerage chain reaction বা PCR।

কিন্তু রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ ও পলিমারেজ এনজাইমগুলো মানুষের আরএনএ ও করোনাভাইরাসের আরএনএর মধ্যে তফাৎ করবে কীভাবে? এর জন্য আমাদের দেখতে হবে আবার জিনোমের র দিকে। নোবেল করোনাভাইরাসের সুন্দর গোলাকার আকৃতির ছবিটি এখন বেশ পরিচিত সবার কাছে। বাহিরের অংশে কিছু বিশেষ প্রোটিন থাকে, যাদের নিউক্লিওক্যাপসিড বলে। এ ছাড়া আরও কিছু প্রোটিন থাকে, যা এই ভাইরাসটির জন্য স্পেসিফিক এবং মানুষের দেহে নায়। ওই বিশেষ প্রোটিনগুলো RNA জিনোমের যে অংশ থেকে তৈরি হয়, তার দু পাশের কিছু অংশের সিকোয়েন্স বিজ্ঞানীরা এরই মধ্যে বের করে ফেলেছেন ভাইরাসটির জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের মাধ্যমে। ফলে এই বিশেষ জিনগুলোর দু পাশের কিছু অংশও (১৮-২৫ নিউক্লিওটাইড) আমরা কৃত্রিমভাবে তৈরি করে পলিমারেজ এনজাইমের সঙ্গে মেশিনের মধ্যে দিয়ে দিই, যাকে primer বলে। তখন পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশনের মাধ্যমে শুধুমাত্র ওই ভাইরাস স্পেসিফিক বিশেষ জিনটির পরিমাণ বহুগুণে বৃদ্ধি পায়।

বিশেষ এই প্রক্রিয়াটি খুবই সংবেদনশীল, ফলে খুব সামান্য পরিমাণের ভাইরাসের RNA উপস্থিত থাকলেও তা বহুগুণে amplifie করে আমরা তার উপস্থিতি ঠিকই টের পেয়ে যাই। একজন মানুষের কাছ থেকে নেওয়া নমুনার ওপর সাধারণত ভাইরাসের দুটি জিনের উপস্থিতি পরীক্ষা করা হয় এবং সেই সঙ্গে মানুষের জিনোম স্পেসিফিক আরেকটি জিনের উপস্থিতি খতিয়ে দেখা হয়, যা ভাইরাসের জিনোমে থাকে না। প্রথম দুটি জিনের উপস্থিতি ভাইরাসটির উপস্থিতি নির্ণয় করবে এবং মানুষের দেহের জিনটির উপস্থিতি প্রমাণ করবে যে, নমুনা থেকে ঠিকমতো আরএনএ আলাদা করা থেকে শুরু করে রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন এবং PCR-এর সবগুলো ধাপ সঠিকভাবে সম্পন্ন হয়েছে কি না।
কখনও কখনও ভাইরাসের উপস্থিতির রেজাল্ট নেগেটিভ আসতে পারে । তখন যাতে পরীক্ষাটি নিয়ে সন্দেহের অবকাশ না থাকে, সে জন্য মানুষের জিনটির PCR এক ধরনের কন্ট্রোল হিসেবে ব্যবহার করা হয়। প্রথম দুটি নেগেটিভ, কিন্তু মানুষের জিনটির উপস্থিতি পজিটিভ হলে রোগীর কোভিড-১৯ নেই বলে ধরা হয়। আবার প্রথম দুটি পজিটিভ কিন্তু মানুষের জিনটির উপস্থিতি অনেক সময়ে নেগেটিভ আসতে পারে। সে ক্ষেত্রে ভাইরাসের যেকোনো একটি জিনের জন্য PCR পজিটিভ এলেই নমুনাটি কোভিড-১৯ পজিটিভ-এর সন্দেহের তালিকায় রাখা হয় এবং প্রয়োজনে পুনরায় PCR পরীক্ষা করা যেতে পারে।

মানুষের জিনটির উপস্থিতি অনেক সময় আরএনএ কম পরিমাণে থাকলে নাও আসতে পারে। কিন্তু যদি তিনটি PCR-ই নেগেটিভ আসে অর্থাৎ ডিএনএ বৃদ্ধি হতে না পারে, তাহলে আবার নমুনা সংগ্রহ করে পরীক্ষাটির পুনরাবৃত্তি করতে হবে। এখানে বলে রাখা উচিত যে, PCR-এর পজিটিভ বা নেগেটিভ ফলাফলের সঙ্গে সঙ্গে রোগীর মধ্যে রোগের কী কী লক্ষণ দেখা গেছে, তার অন্য কোনো অসুখ আছে কি না এবং আনুষঙ্গিক লক্ষণসমূহ বিবেচনা করে, তবেই রোগীর কোভিড-১৯ আছে কি নেই তা নির্ণয় করতে হবে। PCR-এর জন্য নমুনাগুলো তৈরি করার সময় প্রতিটি ধাপে খুব সতর্কতা অবলম্বন করতে হয়। নমুনা সংগ্রহ থেকে শুরু করে মেশিনে বসানোর আগে পর্যন্ত প্রতিটি ধাপে এ সতর্কতা অবলম্বন করতে হয়। কোনোভাবে একটি নমুনার সঙ্গে আরেকটি নমুনা মিশে গেলে PCR-এ ‘ফলস পজিটিভ’ ফলাফল আসতে পারে। অর্থাৎ, প্রকৃতপক্ষে রোগীর কোভিড-১৯ না থাকলেও রেজাল্ট আসতে পারে যে—তার আছে। আবার নমুনাগুলো সংগ্রহের সময় সঠিক ব্যবস্থা গ্রহণ না করা হলে বা ঠিকমতো সংরক্ষণ না করলে বা জিনে কোনো ধরনের mutation বা পরিবর্তন থাকলে primer টি ঠিকমতো সংযুক্ত হতে পারে না ডিএনএর সঙ্গে। এ ক্ষেত্রেও PCR-এ ‘ফলস নেগেটিভ’ রেজাল্ট দেখাবে। অর্থাৎ রোগীর কোভিড-১৯ থাকলেও রেজাল্ট আসতে পারে যে, তার রোগটি নেই। যা রোগীর সঠিক চিকিৎসার অন্তরায় হয়ে দাঁড়াতে পারে। এজন্য এই রোগ নির্ণয়ের প্রতিটি ধাপ অত্যন্ত সতর্কতার সঙ্গে অনুসরণ করতে হয়।

rt-PCR-এর basic বলতে গেলে এতোটুকুই।।। কিন্তু এই যে DNA বহুগুণে বৃদ্ধি পেল, আমরা কীভাবে এটি চোখে দেখতে পারব? সাধারণত PCR করে আমরা এক ধরনের জেলের মধ্যে ইলেকট্রিসিটির সাহায্যে PCR product-কে গতিশীল করে ডিএনএতে সংযুক্ত হতে পারে-এমন কিছু chemical এর সাহায্যে UV রশ্মির নিচে এর উপস্থিতি দেখতে পারি। এই সিস্টেমটি আমাদের দেশের বেশির ভাগ মলিকিউলার বায়োলজি ল্যাবরেটরিতেই আছে। কিন্তু রোগীর নমুনা পরীক্ষার জন্য প্রতিবার PCR করে জেলের মাধ্যমে দেখাটা বেশ সময় এবং শ্রমসাপেক্ষ। এ জন্য আমাদের দরকার হয় RealTime-rt-PCR নামের বিশেষ অতি আধুনিক PCR মেশিন। এর বৈশিষ্ট্য হচ্ছে পলিমারেজ এনজাইম, নমুনার RNA ও primer এর সঙ্গে কিছু ফ্লুরোসেন্ট ডাই যুক্ত করে দিতে হয়। পলিমারেজ এনজাইমের সাহায্যে DNA যখন এক সূত্রক থেকে দ্বিসূত্রক হয়, তখন এই primer বা prove এর সঙ্গে লাগানো ফ্লুরোসেন্ট ডাইগুলো বিশেষ একটি তরঙ্গে আলো বিকিরণ করে, যা এই RealTime-rt-PCR মেশিনটির মাধ্যমে আমরা দেখতে পাই। ডিএনএর সংখ্যা যত বাড়তে থাকে এই বিকিরণের পরিমাণও তত বাড়তে থাকে। বাস্তবিক অর্থেই স্বচক্ষে মেশিনের মনিটরে DNA এই সংখ্যা বৃদ্ধিটুকু দেখতে পাই। ফলে খুব অল্প সময়েই আমরা ভাইরাসটির উপস্থিতি একটি ‘S’ আকৃতির গ্রাফের মাধ্যমে দেখতে পাই। আর অনুপস্থিত থাকলে DNA বৃদ্ধি পাবে না, গ্রাফটিও তৈরি হবে না। ফলে কী পরিমাণে ডিএনএ বৃদ্ধি পেল, সে সম্পর্কেও ধারণা পাওয়া যায় দেখে একে quantitative rt-PCR-ও বলা হয়ে থাকে। তবে রোগীর নমুনাতে ভাইরাসের জিনের উপস্থিতি আছে কি নেই সেটুকু দেখাই রোগ ডায়াগনোসিসের জন্য যথেষ্ট।

RealTime-rt-PCR মেশিন বেশ দামি , যা ব্যবহার করে বিজ্ঞানীরা গবেষণার কাজ করে থাকেন। মহামারির মতো দুর্যোগকালীন সময়ে এই মেশিনগুলো সঠিক ব্যবস্থাপনার মাধ্যমে রোগ নির্ণয়ের কাজে ব্যবহার করা যেতে পারে। এই মেশিনগুলোতে সাধারণত ৯৬টি টেস্ট করার মতো জায়গা বা খঁাজ (ওয়েল) থাকে। মেশিনের ব্র্যান্ড ভেদে ৩৬ থেকে শুরু করে ৩৮৪টি টেস্ট করার মতো জায়গাও থাকে। রোগীর নমুনা পরীক্ষার সময় সব সময় একটি পজিটিভ ও একটি নেগেটিভ কন্ট্রোল দিতে হয়। পজিটিভ কন্ট্রোল অর্থ হচ্ছে এটি সব সময় পজিটিভ ফল দেখাবেই, সাধারণত যা নেওয়া হয় করোনাভাইরাসের আরএনএ থেকে। নেগেটিভ কন্ট্রোল সব সময় নেগেটিভ ফল দেখাবে; এটা হতে পারে সাধারণ স্টেরাইল স্যালাইন যাতে কোনোভাবেই ভাইরাসের বা মানুষের আরএনএ আসার কোনো সুযোগ নেই।

প্রতিটি রোগীর নমুনা থেকে আমাদের কমপক্ষে তিনটি পরীক্ষা করতে হয়। সুতরাং এভাবে ৯৬ ওয়েল-এর একটি মেশিন একবার চালালে আমরা ৩০টির মতো রোগীর নমুনা পরীক্ষা করতে পারব। এ পরীক্ষা সম্পন্ন হতে দেড় থেকে দুই ঘণ্টা সময় লাগে। এক দিনে মেশিনটি একাধিকবার চালানো যায়। তবে multiplexing নামক একটি ব্যবস্থার ফলে আমরা একসঙ্গে ৯০ জন রোগীর নমুনাও ৯৬ ওয়েলের মেশিনে পরীক্ষা করতে পারব। multiplexing প্রক্রিয়াতে আমরা একজন রোগীর নমুনার জন্য যে তিনটি জিনের rt-PCR করব, তাদের প্রাইমারগুলোর সঙ্গে তিন ধরনের ফ্লুরোসেন্ট ডাই সংযুক্ত করে দিতে পারি। ফলে মেশিন একটি well-এর মধ্যে দেওয়া নমুনাতেই তিন ধরনের ফ্লুরোসেন্ট শনাক্ত করে তিনটি ভিন্ন রঙের গ্রাফ দেখাবে। ফলে আমাদের তিনটি জিনের জন্য আলাদা well ব্যবহার করতে হচ্ছে না। তাই প্রয়োজন হলে একটি মেশিনের মাধ্যমে এক দিনে কমপক্ষে ১৮০ বা ততোধিক নমুনাও পরীক্ষা করা যায়। দক্ষ হাতে যথেষ্ট জনবল নিয়ে কাজ করলে এক দিনে আরও অনেক বেশি নমুনাও পরীক্ষা করা সম্ভব। তবে অবশ্যই নমুনা সংগ্রহ থেকে PCR পর্যন্ত প্রতিটি ধাপে যেন প্রয়োজনীয় সতর্কতা অবলম্বন করা হয়, সেদিকে খেয়াল রাখতে হবে।

RealTime-RT-PCR-এর জন্য যে রিঅ্যাজেন্ট ব্যবহার করা হয়, তার ভিন্নতার কারণে অনেক সময়ে ডায়াগনোসিস এর খরচ কম-বেশি হতে পারে। সাইবার গ্রিন নামের আরেক ধরনের ফ্লুরোসেন্ট ডাই ব্যবহার করে দক্ষিণ কোরিয়ার একদল বিজ্ঞানী দেখিয়েছেন, কীভাবে খরচ কমিয়ে আনা যায়। এ ছাড়া ভাইরাসের উপস্থিতি LAMP নামের আরেক ধরনের PCR-এর মাধ্যমে নির্ণয় করা যায়। সাধারণ PCR-এর সময় প্রতিটি সাইকেল বা চক্রে তিনটি ধাপ সম্পন্ন হয়। প্রথমে ৯৫ ডিগ্রি তাপমাত্রায় দ্বিসূত্রক ডিএনএ আলাদা হয়ে একসূত্রক হয়, এরপরে ৫৫-৬৫ ডিগ্রি তাপমাত্রায় কৃত্রিমভাবে তৈরি করা প্রাইমারগুলো ডিএনএর নির্দিষ্ট জিনের সঙ্গে যুক্ত হয় এবং ৬৫-৭২ ডিগ্রিতে পলিমারেজ এনজাইমের সাহায্য প্রতিটি একসূত্রক ডিএনএ থেকে দ্বিসূত্রক ডিএনএ তৈরি হয়। অর্থাৎ PCR-এ যদি ৪০টি সাইকেল দেওয়া হয়, তাহলে এই তিনটি ধাপ ৪০ বার করে হবে, যা কিছুটা সময়সাপেক্ষ। LAMP-এ বিশেষ এক ধরনের পলিমারেজ ব্যবহার করা যায়, যা নিজে নিজেই দ্বিসূত্রক ডিএনএকে ভেঙে একসূত্রক বানাতে পারে। ফলে বিভিন্ন তাপমাত্রার তারতম্য করতে তিনটি ধাপের প্রয়োজন হয় না। মাত্র একটি তাপমাত্রাতেই বেশ কম সময়ে এটি সম্পন্ন হতে পারে।

PCR মেশিনের প্রধান কাজ হচ্ছে, তাপমাত্রার এই ওঠা-নামা নিয়ন্ত্রণ করা। সুতরাং হাতের কাছে PCR মেশিন না থাকলেও প্রয়োজনে নির্দিষ্ট তাপমাত্রায় গরম পানির water bath তৈরি করে তার মধ্যে নমুনার টিউবগুলো পলিমারেজ, প্রাইমার ও অন্যান্য উপকরণ দিয়ে রেখে দিলেও PCR করা সম্ভব। এতে ৬ ধরনের প্রাইমার একসঙ্গে ব্যবহার করে এক ধরনের লুপ তৈরি করে। তারপর ডিএনএর সংখ্যা বৃদ্ধি পায়। এ জন্য একে বলে Loop-Mediated Isothermal Amplification। তবে বেশির ভাগ জায়গাতেই এখন পর্যন্ত রোগ নির্ণয়ের জন্য RealTime-rt-PCR-ই বেশি করা হচ্ছে।

অতঃপর rt-PCR সর্বাধিক নির্ভরযোগ্য করোনা সনাক্তকরণ প্রক্রিয়া।।যে প্রক্রিয়াটি নোবেল করোনা ভাইরাস সনাক্ত ও চিকিৎসা ব্যবস্তায় বিশেষ ভূমিকা রাখছে।।